天然水蛭素的作用

水蛭素是水蛭所含主要有效成分。1884年习·B．Hay-craft首先从医用水蛭的提取物中发现了这种抗凝血的物质；1904年，Jacoby将这种抗凝血的物质定名为水蛭素；1955年，Markwardt确定水蛭素为65个氨基酸的肽，是血栓形成的一种特异抑制剂；1976年，Petersen等阐述了水蛭素的氨基酸序列，在其Val—Val氨基末端第63位上为硫化蛋氨酸；1980年，Baskova等从水蛀头部提取的水蛭素中确定了一个11e—Val氨基末端；1984年，Dodt等确定了Petersen的Val—Val序列，同时发现了两种变异体。其中一种称为水蛭素PA，另一变异体尚未弄清。水蛭素PA有66个氨基酸剧末端带Ile-Thr。Brauer等描述了另一种有较长氨基酸链的变异。所有变异都由65或66个氨基酸组成，第63位为含硫蛋氨酸。

1．结构特点

(1)水蛭素的结构：

水蛭素是水蛭刺伤人时从口腔腺体中分泌出的一种抗凝血物质，导致刺伤局部出现流血不止的现象，便于水蛭吸吮血液。药用水蛭素是灰白色粉末，由HirudomedicinaisL提取精制所得，为多种氨基酸残基组成的单链多肽。肽链中不含精氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。六个半胱氨酸组成的三个二硫桥位于肽链的N端区域，酸性氨基酸集中在C端区域，在C末端的最后九个氨基酸残基中有五个酸性氨基酸，并有一个硫酸化的酪氨酸。肽链中部还有一个由Pro—Lys47—Pro组成的特殊序列。

核磁共振研究表明，在水蛭素多肽链中无n—螺旋结构，并把水蛭素分子分成三个区域，一个突出的指区(31—36氨基酸残基构成)，一个暴露的环区(47—55氨基酸残基构成)，一个中心核区(由3—30、33—46和56—57氨基酸残基构成)。通过二硫桥集结而成的，N端是疏水的，而C端是亲水的，游离在分子的表面。水蛭素的CD谱不能用传统的蛋白质二级结构的三个成分(n—螺旋、良折叠和无序结构)来说明。实验表明，椭圆率在200和240nm之间的变化，不是因为。—螺旋，而可能是三个二硫桥和Tyr—SO，的贡献。

(2)水蛭素的组成：

水蛭素由门冬氨酸(16)、谷氨酸(13)、半胱氨酸(6)、丝氨酸(4)、甘氨酸(9)、苏氨酸(4)、丙氨酸(1)、缬氨酸(3)、亮氨酸(4)、异亮氨酸(2)、脯氨酸(2)、苯丙氨酸(2)、酪氨酸(2)、组氨酸(1)、赖氨酸(4)等15种74个分子、68个分子或65个分子氨基酸组成。分子量为2000、7000或852的蛋白质水解物。分子式CaoH600zoN。，也有的认为分子量为13000。分子量在7000左右者认为分子中含有三个二硫键。水蛭素在肽链N末端有一白氨酸或异白氨酸群。分子中含有大比例的二羟基氨基酸类，所以呈酸性反应，但组成中无色氨酸、甲硫氨酸和精氨酸。等电点pH为3．8(4．0)。目前已分离出7种水蛭素的异构体，纯的水蛭素常常以多聚体的形式存在。

2．构效关系

(1)结构与功能的关系：

水蛭素的二级和三级结构对其抗凝活性起决定作用。二硫键是决定其分子结构的稳定性，保持高度抗凝活性的关键部分。当二硫键被氧化或还原，或分子中发生了蛋白质降解，则失去抗凝活性。若分子的羧基被酯化或失去酸性的C端氨基酸，也会失去与凝血酶结合的能力。研究揭示，水蛭素与凝血酶活性位置结合的结构单元，仅存在于C端残基中。而水蛭素的N端虽无与凝血酶结合的位置，但结合到凝血酶上的水蛭素的N端的残基亦有抑制凝血酶催化活性作用。在研究水蛭素N端构型对其同凝血酶作用的影响时，发现N端残基的疏水性结构对水蛭素抗凝血酶作用有重要影响。肽链中由Pro-Lys47—Pro组成的特殊序列，不被一般蛋白酶所降解，这个特殊结构在水蛭素与凝血酶的相互作用中具有重要的功能。

(2)肽链对水蛭素活性的影响：

Dodt等人研究发现，羧端缩短了三个氨基酸残基的水蛭素与凝血酶的反应，其抑制常数Ki增加了15—20倍。用滴定法测定进一步证明，缩短了6或8个羧端氨基酸，将大大降低水蛭素的抑制活力，删去9个氨基酸以上的水蛭素几乎失去全部抑制活力。很明显，水蛭素的羧端对其抑制活力有重要影响。根据这些结果推测，水蛭素与凝血酶之间紧密复合物的形成，要求羧端氨基酸与反应位点(Pro—Lys+，—Pro)之间要有适当的距离，而羧端的缩短可能引起水蛭素分子构型的改变，导致蛋白酶与抑制剂之间的相互作用减弱。羧端第63位酪氨酸残基的去硫酸化对水蛭素的抑制活力也有影响，其结果与羧端缩短了三个氨基酸的水蛭素的效应相同。但是，全部去硫酸化的水蛭素仍保持着最初活力的45％。这种硫酸化的功能尚不十分清楚，它可能涉及到与凝血酶的直接作用，或是稳定水蛭素的结构。动力学研究表明，在所有情况下，解离常数的增加，是由于结合常数减少所致，实验再次证明水蛭素酸性的羧端区对其与凝血酶的相互作用的影响是至夭重要的。

(3)水蛭素与凝血酶：

水蛭素与凝血酶相互作用的研究发现，水蛭素分子二硫桥的氧化与还原，蛋白水解酶的降解作用，重要氨基酸的突变，都会引起水蛭素分子二级和三级结构的改变，严重影响水蛭素抗凝活性。为说明水蛭素与凝血酶相互作用的机理，除了要了解水蛭素分子的结构特点外，还必须掌握凝血酶的性质，它的哪些部位与水蛭素起反应。目前认为，凝血酶是由三个功能截然不同的区域组成，即所谓原发特性口袋(凝血酶的催化点在此)、非极性的结合位点和阴离子结合区域(它负责与纤维蛋白原的相互作用)。那么，水蛭素与凝血酶之间是如何相互作用的呢?研究表明，被二硫桥所稳定的水蛭素分子的氨基末端与酶的非极性结合位点有关系，其中的二氨基吖啶被水蛭素所取代。水蛭素分子羧端则结合到酶的阴离子结合部位。被认为是水蛭素的反应位点的碱性侧链，主要是指Pro-Lys47—Pro占据了酶的特性口袋部位。但是，水蛭素不同于其它已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白，凝血酶并非强烈地依赖于抑制剂蛋白的这一假定的反应位点，可能还有独立于反应位点的其它识别结合位点。水蛭素与凝血酶特异地相互作用的更详细区域有待于深入研究。

3．水蛭素的稳定性

水蛭素在干燥状态下是稳定的。于室温下在水溶液中可稳定6个月，80~C下加热15分钟不被破坏。提高pH值，则稳定性降低。胰蛋白酶钠和。—糜蛋白酶不破坏水蛭素的活性，而番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A可使水蛭素失去活性。所以，水蛭素一般不受热和乙醇的破坏，对于制剂生产是有利的。