奶牛鲜乳中黄曲霉毒素Ml的产生及危害 黄曲霉毒素Ml的检测方法

奶牛生鲜乳中含有过高的黄曲霉毒素M1主要是由于其采食大量发生霉变的饲料、饲草,导致体内含有大量的黄曲霉毒素B1,通过体内代谢生成黄曲霉毒素M1,并存在于肝脏、肾脏、乳腺以及乳汁中,且经过24 h就能够检测到牛奶中存在黄曲霉毒素M1.现主要介绍奶牛鲜乳中黄曲霉毒素Ml的产生及危害 黄曲霉毒素Ml的检测方法，大家一起来具体了解一下：

1、产生及危害

哺乳类动物主要是采食污染有黄曲霉毒素Bl的饲料或者食品而导致分泌的乳汁中含有黄曲霉毒素Ml。一般来说，农作物在生长过程中遇到各中自然灾害，如干旱、早霜、虫害、倒伏等，以及收获后在加工、运输、储藏过程中不合理，如贮藏湿度大等，都容易感染黄曲霉菌。在温度、湿度适宜的条件下，就会生成一定数量的黄曲霉菌，黄曲霉毒素就是其产生的代谢物。

奶牛采食污染有黄曲霉毒素Bl的饲料后，进入的黄曲霉毒素Bl就会与微生物逐渐产生相互作用，其中10%作用的毒素能够在瘤胃内菌群的作用下发生降解，其他部分毒素即会被瘤胃吸收进入血液，并在体内的肝微粒体单氧化酶系的催化下，经由细胞色素P-　450的调节，导致黄曲霉毒素Bl末端存在的呋喃环C-10发生羟基化而生成黄曲霉毒素Ml。由于黄曲霉毒素Ml没有活性，从而能够直接经由尿液排到体外，或者结合葡萄糖醛酸基转移酶而经由粪便排到体外或者通过乳汁排到体外，还有部分能够残留在肌肉内。

进入动物或者人类体内的黄曲霉毒素Ml，不仅能够抑制合成RNA、DNA，还能够抑制肝脏合成蛋白质，引起机体中毒，主要表现在以下三个方面，即损伤组织器官；抑制免疫功能；致畸、致癌、致突变，导致人类和动物发生胃癌、肾癌和肝癌等。

2、检测方法

薄层色谱法(TLC)。该方法是测定牛奶中黄曲霉毒素Ml含量的经典方法，是一种比较定性或者半定量的检测方法。其原理是对牛奶样品进行提取、浓缩、薄层分离后，使黄曲霉毒素Ml能够在36b　nm波长的紫外光下发出蓝紫色荧光，从而根据标准溶液的荧光强度以及其在薄层板上表明的荧光最低检出量相比较，进而计算其含量。分析时，先配制黄曲霉毒素Ml标准溶液，即使用三氯甲烷配制浓度为10　;ug／mL的黄曲霉毒素Ml标准溶液，置于3b7　nm波长的紫外分光光度计中测定该标准溶液的准确浓度，然后放置在4℃条件下进行避光保存、备用。接着提取样品，即直接将液体样品添加在甲醇中，经过振荡后过滤的提取液。提取液可先用氯化钠溶液和石油醚进行分配净化，接着使用三氯甲烷进行转相提取，再使用氯化钠溶液进行水洗，然后使用无水硫酸钠进行脱水，并收集三氯甲烷层放在65℃水浴中，保持通风良好，使其逐渐挥干，最后将蒸发皿中的残留物通过三氯甲烷转移到浓缩管内，并经过减压吹气法使该溶液浓缩到适当体积后备用。点样层析、展开、测定，即分别取10uL标准液和样品用浓缩液，并点滴在硅胶G薄层板（在105℃经过2h活化）上，放在展析缸（提前添加一定量的展开剂）中展开，注意纵展和横展相结合，待挥干后置于紫外灯下进行观察，并测量其Rf值，通常黄曲霉毒素Ml的Rf值是o．34，还要同标准溶液的最低检出量(0.　0004　;ug)的荧光强度进行比较，同时在荧光点处喷洒适量的硫酸溶液(1：3)显色剂，用于确证试验，最后根据标准溶液最低检出量、样品称量值、浓缩体积以及总稀释倍数进行计算黄曲霉毒素M1含量。

SNAP法。主要是根据酶联免疫竞争原理，即样品中含有的黄曲霉毒素Ml同定量特异性酶标抗体发生反应，多余的游离酶标抗体就会同酶标板内的包被抗原相结合，经过流动洗涤后添加适量的酶显色底物进行显色，最后与标准点进行比较定性。检测前，要先打开SNAP加热器和黄曲霉毒素Ml检测读数仪进行预热，SNAP加热器的温度适宜达到(45±5)℃，接着将装在包装内的黄曲霉毒素Ml检测试剂盒取出、备用；待检测的生鲜乳温度适宜控制在15　-　30℃之间，并按照顺序将其排好。调节加热器的加热时间和反应时间，分别为5　min、4　min。检测时，先将待测生鲜乳摇匀，接着将黄曲霉毒素Ml检测试剂盒内的配套吸管取出，在试剂瓶中添加(450±50uL)标准线的待测奶样，然后摇晃试管促使反应试剂球完全融化，之后将试管放在已经预热的加热器中，对样本进行5　min孵化，接着立即取出样品试管，并将其中的样本添加到SNAP试剂盒样品孔中，样本通过反应窗朝向反应激活环流动。待绿色反应环即将发生退色时，要立即用力按下反应激活键，使其与SNAP试剂盒持平，听到清脆的按扣声后要按下反应键，经过4　min反应，将SNAP试剂盒取下，置于读数仪下调成快速读数一抗生素类一读数，要求在反应完成后的10　min之内读完。读数仪读数在1.05以上，则检测结果为阳性；读数在1.　05以下，则检测结果为阴性。另外，还要注意对试剂盒样品点和参照点的颜色变化及深浅度进行观察，如果样品点颜色浅于参照点，结果即为阳性；样品点颜色等于或者深于参照点，结果即为阴性。如果参照点颜色没有发生变化，则要重新对样品进行检测，而对于结果为阳性的样品还需要采取定量法进行进一步确认。