FSH对体外培养犊牛支持细胞DDX4和TPX1基因表达的影响

实验研究FSH对体外培养支持细胞的DDX4和TPX1表达情况的影响,为深入研究体外精子发生提供理论和实践依据。以培养的犊牛支持细胞为实验材料,共以不同浓度FSH(0、0.01、0.02、0.04、0.08IU/mL)处理支持细胞,3个时间点的DDX4和TPX1的表达情况通过Realtime-PCR被检测。下面具体来了解一下！FSH对体外培养犊牛支持细胞DDX4和TPX1基因表达的影响。

支持细胞间的紧密连接形成血睾屏障，血睾屏障又将精细管的生精上皮分为基底小室和近腔小室两个部分，由于两个小室之间拥有不同的微环境，所以可以影响不同阶段的生精细胞发育，基底小室完成生精过程的启动阶段，内含精原细胞和细线期的精母细胞，近腔区靠近精细管的管腔一端，完成减数分裂使生精细胞向成熟精子变形，其中有正在发育的生精细胞和精子细胞。另外，FSH和睾酮等激素通过支持细胞对调节精子发生起到重要作用。DDX4和TPX1是生精细胞产生，他们均是精子发生的必要蛋白。关于他们是否在支持细胞表达还鲜有报道。

本实验体外培养支持细胞，通过FSH的作用，探讨几种与精子发生作用的重要基因变化，即DDX4和TPX1，为体外精子发生研究提供理论和实践依据。

1、材料

犊牛睾丸来双城市屠宰场，4h内运送回实验室．DMEM(Gibco)；PBS(Solarbio)；乙二胺四乙酸二钠(Amresco)；胰蛋白酶(1：250，Amresco)；FSH（宁波第二激素厂）；Trizol试剂（哈尔滨英俊生物技术有限公司）；FastStart　UniversalSYBR　Green　Master　(Rox)（德国罗氏公司）；Easy　Taq酶、PrimeSTAR　HS　(Premix)、DNA　Marker、dNTP、oligo　dT引物、各种内切酶和RNase　Inhibitor(宝生物工程(大连)有限公司）；ImProm　II　reverse　transcriptase（Promega公司）；2×Taq　PCR　MasterMix(北京天根公司)。

2、方法

2..1　支持细胞制备

犊牛睾丸组织为试验材料，利用胶原酶和胰酶的组合酶法将其解离成单细胞悬液，并采用差速贴壁法纯化支持细胞后进行体外培养，支持细胞纯度大于95%。

2..2　FSH处理支持细胞

解冻并培养支持细胞，初始细胞密度为3．O×10-4个／mL。将不同浓度FSH随机分为五组，A组，0.OlIU／mLFSH;B组，0.02IU／mL　FSH;C组，0.04IU／mL　FSH;D组，0.08IU/mLFSH,　CK组(Control　check)OIU/mLFSH.

2..3　细胞收集

以3．O×104个／mL的密度将支持细胞接种到多个6孔板，将细胞孔分为五组，每组9孔细胞。6h细胞贴壁后分别更换为5种不同浓度FSH培养基，空白组更换为全培养基，并以此时记做Oh。在6h、12h、24h时，分别向各组3个待测孔加1　mL　Trizol，吹打数次，收集细胞移入1.5mLEP管中，-80℃保存。

2..4DDX4和TPX1基因的相对定量

根据Trizol说明书提取各组细胞总RNA。总RNA经检测分析合格后进行反转录。反转录按照Promega　Improm　II(Promega，Madison，WI，USA)试剂盒说明书两步法进行操作。为了检测FSH对基因表达的调节能力，通过Realtime　PCR测定DDX4和TPX1的表达量，应用引物序列见表1。引物均由北京华大基因生物技术有限公司合成。

3、讨论与分析

3.1

FSH对支持细胞中DDX4基因表达的影响

DDX4基因为哺乳动物生殖细胞特异表达基因，与精子发生减数分裂密切相关，从减数分裂前就开始表达，在DDX4基因被敲除的纯合突变小鼠中，精子发生受阻于第一次减数分裂前期的偶线期，细胞凋亡，不能产生精子，显然在小鼠精子发生中偶线期的顺利完成有赖于DDX4基因的表达。实验检测FSH处理后支持细胞中DDX4基因mRNA表达量，结果一定浓度的FSH能够促进DDX4基因mRNA的表达增加。同时，支持细胞的紧密连接将曲细精管的基底区和近腔区处于不同的微环境中，近腔区是经减数分裂产生单倍体细胞，所以支持细胞有可能够通过FSH作用产生DDX4参加减数分裂促进精子发生，并且DDX4可能是近腔区微环境中的减数分裂因子。

3.2 FSH对支持细胞中TPX1基因表达的影响

TPX1是在雄性生殖道中特异性表达的富含半胱氨酸的分泌蛋白，在睾丸特异性表达，有关于TPX1生物特性报道指出，TPX1的mRNA在生精细胞粗线期精母细胞有表达，并持续表达到成形精子形成，同时TPX1蛋白也持续进行表达，TPX1可以做为精母细胞和其他防治细胞功能联系的分子桥梁。本实验表明不同浓度的FSH处理支持细胞后TPX1表达量均显著提高，推测支持细胞产生的TPX1参与支持细胞与生精细胞的连接和功能传递，并进一步影响精子的发生。

4、结论

在一定浓度范围内，FSH显著促进DDX4、TPX1基因的表达，DDX4在12h左右表达量最高，TPX1在24h左右表达量最高。