褪黑素对肉羊体外胚胎生产效果的影响实验

卵母细胞与胚胎体外培养过程中，细胞处于相对高氧环境，常常会由于抗氧化防御不足而导致氧化应激，使细胞在发育过程中积累大量的活性氧，从而降低卵母细胞及胚胎的体外发育率。褪黑素作为一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂，能显著降低细胞内ROS水平，清除细胞内自由基，改善卵母细胞的体外成熟与胚胎的体外发育历程。下面具体来了解一下：褪黑素对肉羊体外胚胎生产效果的影响实验。

1、材料与方法

1.1　实验材料

屠体卵巢来源于羊屠宰场，摘取屠体羊卵巢后立即放于添加有双抗(1　000　lU／mL)的30℃生理盐水中，在2h内运回实验室。

1.2主要试剂

(1)抽卵液：TCM199(Hepes)+10%胎牛血清(FBS)+6　IU／mL肝素+100　IU／mL青、链霉素

(2)成熟培养液：TCM199+10%　FBS—-10g/mL促卵泡激素(FSH)—-lug／ml)雌二醇(E2)+10　ug／ml.促黄体素(LH)+10　ng／mL表皮生长凶子(EGF)+0.1　mmol／L半胱氨酸+1%　PS

(3)受精液：SOF十6　mg／mL　BSA+20uL/ml.肝素钠+1%　PS

(4)获能液：S()F+3　mg／mL　BSA—-2　mg／mL咖啡凶+1%PS

(5)胚胎培养液I液：SOF—-3　mg／mL　BSA—-l%　PS

(6)胚胎培养液Ⅱ液：SOF—-10%　FBS+1%　PS

1.3　方法和步骤

1.3.1卵母细胞的采集

从屠宰场采集羊卵巢带回实验室，用无菌生理盐水清洗3次。抽取卵巢表面上直径为2～8　mm的卵泡中的卵泡液，在体视显微镜下挑选具有完整卵丘细胞且胞质均匀的卵丘卵母细胞复合体(C()Cs)进行实验。

1.3.2　卵母细胞体外成熟率的统计

培养成熟24　h的卵母细胞，用O.l%透明质酸酶消化去除卵丘细胞。然后在体视显微镜下观察统计第一极体排出率（即卵母细胞成熟率）。

1.3.3囊胚细胞计数

收集体外受精培养至第7天的囊胚4～5枚，进行细胞核染色。具体步骤是：用PBS/PVP洗囊胚3次，用酸性台式液去除囊胚的透明带，后用PBS/PVP洗3次，冉移入3.7%多聚甲醛中室温固定3min，然后用PBS/PVP洗3次，放入配制好的10　ug/ml』的Hoechst333/12染液中10min最后用PBS/PVP洗3次，囊胚置于载玻片中央，压片，封片，在倒置荧光显微镜下照相，统计囊胚细胞数日。1.4数据处理

试验重复3次，试验数据用Excel2003软件建立数据库进行数据整理，采用SPSS17.O软件对数据进行单因素方差分析，结果用平均值±标准差表示，以P<O.05作为差异显著性判断标准。

2、实验结果

2..1　褪黑素对肉羊卵母细胞成熟率（第一极体排出率）的影响

卵母细胞体外成熟液中添加10-Ⅱlol／L和lO-smol／L褪黑素，牛体外成熟卵母细胞成熟率显著高于对照组和10-10mol／L褪黑素处理组(P<O.05)．而这两组之间没有显著差异(P>O.05)。l0-1omol／L褪黑素处理组与对照组无显著差异(P>0.05)。

2..2　褪黑素对体外受精胚胎发育的影响

不同浓度褪黑素(lO-10mol／L、10-9mol／l.、lO-smol／L)对体外受精胚胎的卵裂率及囊胚率的影响不同。lO-smol／l.、10-9mol／l』褪黑素与对照组之间差异极显著(P<0.01)，与10-10褪黑素组差异显著(P<0.05)。而lO-8、lO-9mol／L褪黑素这两组之间的囊胚率没有显著差异(P>0.05)。不同浓度的褪黑素组囊胚细胞数无显著差异(P>0.05)，但褪黑素处理组的凋亡细胞比例显著低于对照组(P<0.05)，10-&acute;　mol／L处理组的凋亡比例也显著低于lO-10mol／L组(P<0.05)而l0-1omol／L和10-9　mol／L褪黑素这两组之间

3、讨论

3.1　褪黑素对卵母细胞体外成熟的影响

卵母细胞在体外成熟过程中不断发生氧化应激反应，而卵子在体内生长成熟过程中，卵巢中不断有抗氧化应激的物质产生清除过氧化物质。体外氧化损伤会导致卵母细胞发育阻滞，卵母细胞的体外成熟质量降低。本研究证明：在体外成熟过程中，外源添加抗氧化剂褪黑素的适宜添加浓度为10-91TIOl／L，卵母细胞的成熟率最高，卵裂率、囊胚率及囊胚活细胞数显著高于对照组。浓度过高会对细胞产生毒害作用，过低则不足以完全清除细胞氧化应激时产生的过氧化物，但也好于对照组。褪黑素除了具备抗氧化调节，辅助卵泡生长凶子的调节。

3.2褪黑素对体外受精的影响

在体外受精液中添加褪黑素显著降低了精子胞内ROS水平，受精后，精子携带的代谢产物ROS可能会对卵母细胞的胞质造成损伤减小。发生氧化损伤的精子人卵后，携带的脂质过氧化产物和DNA碎片等会损伤卵母细胞的胞质，影响体外受精率、受精后囊胚的发育能力口]。精子在体外操作过程中，会产生过量的ROS，并且精子在体外操作过程中，去除了精浆中部分的抗氧化系统，使精液调节氧化还原平衡的能力降低。为了提高冻后精子体外受精能力，国内外许多研究者将外源抗氧化剂添加到稀释液中来提高冻后精子质量，其中褪黑素能清除ROS，且能激活多种抗氧化系统，保护精子膜的脂质过氧化，延长精子存活时间，提高冻后精子质量。大量的精子聚集在成熟的卵母细胞周围会产生过量的自由基，影响胚胎的体外发育能力。本研究证明，外源填加抗氧化剂褪黑素可以提高体外受精后体外胚胎的卵裂率。

3.3　褪黑素对体外发育胚胎质量的影响

胚胎发育早期对氧化应激非常敏感，由于体外胚胎抗氧化能力的不足，导致过量的ROS对细胞结构和功能产生毒害作用，从而表现发育阻滞、胚胎碎片现象。在体外条件下，胚胎内部调控机制的改变与外部环境的不适，是导致胚胎发育受阻的基本原凶。

本实验模拟体内环境，以期为科学研究和生产实践提供数量更多、质量更优的胚胎。本实验结果证明：体外胚胎培养液中添加褪黑素显著提高了体外受精胚胎的卵裂率和囊胚发育率，不同浓度的褪黑素对体外受精胚胎细胞凋亡的影响，褪黑素可以起到抗细胞凋亡的作用，但与对照组比较，差异不显著，同时高浓度的褪黑素会促进细胞的凋亡。

4、结论

在体外胚胎全程生产液中添加褪黑素促进发育相关基凶表达，最终显著改善卵母细胞胞质成熟质量。提高卵母细胞成熟率、体外受精胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数，降低胚胎细胞碎片量，提高胚胎的质量。